推送：鸡解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)ELISA试剂盒

ELISA试剂盒预实验设置

一、实验目的

ELISA试剂盒预实验是为了确保实验的准确性和可靠性，验证试剂盒的灵敏度和特异性，同时为正式实验提供参考。通过预实验，可以了解实验条件、操作流程和注意事项，为后续的实验提供指导和帮助。

二、实验原理

ELISA试剂盒是一种基于酶联吸附法的检测方法，通过将特异性抗体或抗原与酶结合，形成酶标抗体或抗原。当待测样本与酶标抗体或抗原发生特异性结合时，酶会催化底物生成有色产物，通过颜色变化来检测待测样本中的抗原或抗体。预实验则是通过调整实验条件，如温度、时间、浓度等，来验证试剂盒的 反应条件。

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三、实验步骤

1. 准备试剂和样本

按照试剂盒说明书准备所需的试剂和样本。确保试剂的质量和有效性，同时对样本进行适当的处理和稀释。

2. 设置实验条件

根据预实验的目的，设置不同的实验条件，如温度、时间、浓度等。一般而言，可以通过设置不同的温度、时间和浓度梯度来寻找 反应条件。

3. 实验操作

按照试剂盒说明书进行实验操作。在每个实验条件下，分别进行多次重复实验，以减少误差和提高实验的准确性。

4. 结果观察和记录

观察实验结果，记录每个条件下的吸光度值或颜色变化情况。通过比较不同条件下的结果，可以确定 反应条件。

四、实验结果分析

1. 确定 反应条件

通过对不同条件下的实验结果进行分析，可以确定 反应条件。这些条件包括温度、时间、浓度等。在 反应条件下，酶标抗体或抗原与待测样本中的抗原或抗体能够充分结合，生成的颜色变化 ，从而得到准确的检测结果。

2. 验证试剂盒的灵敏度和特异性

通过预实验，可以验证试剂盒的灵敏度和特异性。灵敏度是指试剂盒能够检测到的小抗原或抗体浓度；特异性则是指试剂盒只与特定的抗原或抗体结合，不与其他物质发生交叉反应。在预实验中，可以通过比较不同浓度的标准品或已知样本的检测结果，来评估试剂盒的灵敏度和特异性。

五、注意事项

1. 严格遵守实验操作规程，避免污染和交叉反应。
2. 在使用试剂盒时，要注意试剂的有效期和质量，避免使用过期或质量不佳的试剂。
3. 在实验过程中，要注意观察实验现象，及时记录和整理实验数据。
4. 在分析实验结果时，要结合试剂盒说明书和相关文献资料，进行科学合理的解释和评估。

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阻断ELISA
本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪（TGE）、猪伪（PR）及猪胸膜（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。
本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。
抗体捕捉ELISA
本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：
① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
斑点ELISA
与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：
⑴载体膜的预处理及抗原包被 取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜 干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。
⑵ 封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
⑶ 加被检血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。
⑷ 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。
⑸显色 加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。
⑹ 结果判定 以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。
布ELISA
（C－ELISA） C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大学者Blais,B. W.等于1989年建立的一种新型检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大，可为反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA的主要程序为：
⑴ 把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭；
⑵ 加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；
⑶ 加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次；
⑷ 加入底物液显色；
⑸ 测定OD值。