酶联吸附实验 (ELISA) 是一种定性或定量检测,使用抗体来结合并测定目的分子。与其他检测相似,可使用单克隆抗体和多克隆抗体来检测分析物(如肽、蛋白、抗体和小分子)。抗体对分析物产生特异性,并且一部分(如辣根过氧化物酶 [HRP])直接或间接偶联抗体,从而提供检测方法并实现可能的信号放大。通过多种ELISA方法和检测化学成份,可以让终端用户调整适当的检测,以解决预计的实验问题。该方法可以用于单份样品检测或高通量筛选。

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直接 ELISA

在直接 ELISA 中,抗原直接结合微孔板表面,随后添加直接偶联的抗体来结合/检测。简而言之,实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂,防止检测抗体出现非特异性结合。接下来,添加直接偶联某种酶(如 HRP)的检测抗体。该检测抗体将结合抗原,并且剩余的抗体会从孔中洗掉。随后添加这种酶的底物,短暂孵育后,通常在一个读板机上测定每个孔的信号。直接 ELISA 的实验步骤有限,可让实验设置整体简化。

直接法优缺点:

优点:1:快速,仅使用一种抗体且步骤较少;2:消除了 抗体的交叉反应性。

缺点:1:一抗的反应性可能受到酶或标签标记的不利影响;2:为每个特定的ELISA系统标记一抗,既费时又昂贵;3:由于标记的抗体密度较低导致较低的灵敏度;4:抗原的固定化不是特异性的,有较高背景干扰。

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间接 ELISA

间接 ELISA 类似于直接 ELISA;但主要的差别在于会通过 偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂,防止结合抗体出现非特异性结合。第三,添加一种抗原特异性结合抗体,短暂孵育后,用缓冲液洗涤板孔,以去除多余的试剂。下一步是“间接”检测,其中添加一种抗体来检测 结合抗体。这种抗体通常偶联某种酶。在孵育和洗涤板孔之后,添加该酶的底物。随后,短暂孵育后,通常在一个读板机上测定每个孔的信号。 抗体通常是一种抗物种抗体。间接 ELISA 的主要优势在于可以使用偶联的 抗体来进行多个实验,前提是在所有不同的实验中使用相同物种的结合抗体。另一个优势是 抗体会放大信号,因为大约 2 个抗体将结合 抗体。随着步骤数量的增加,实验步骤通常会耗时更长,并且更容易出错。此外,背景信号可能会增强,因为所需的试剂数量更多,每一种都可能会出现非特异性结合。

间接法优缺点:

优点:1:可以在一个物种中制备许多一抗,并且可以将相同的标记二抗用于检测;2:由于没有标记,保留了 抗体的 反应性;3:高标记的二抗密度可实现高灵敏度,从而导致信号放大。

缺点:1:二抗可能会发生交叉反应,从而导致非特异性信号;2:这个过程中需要一个额外的孵育步骤

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竞争性ELISA

竞争性/抑制性 ELISA 也称封闭 ELISA,它对干扰预计信号的程度进行定量,以测定分析物的数量。这样做的一个方法是用一种对靶标有特异性的抗体包被平板。靶标可以偶联某种酶,并用于检测。如果实验含有次于 量的检测靶标,则高浓度的未标记靶标会竞争性地结合,从而减弱信号。这类竞争性实验可用来测定某种特异性分析物的水平。

竞争法优缺点:

优点:1:灵敏度高以及灵活性高;2:能测定微量的分析物。

缺点:1:特异性较低;2:需要酶标记的抗原。